Μέθοδοι Εργαστηριακής διάγνωσης ιογενών λοιμώξεων

Ενδείξεις για Εργαστηριακή Διάγνωση Ιογενών Λοιμώξεων

• Διάγνωση ασθενειών που προκαλούνται από ιούς για τους οποίους είναι ήδη διαθέσιμη αντιική χημειοθεραπεία (ιοί έρπητα, ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV).
• Για τη σωστή διαχείριση του ασθενούς Παράδειγμα:
  • Ερυθρά, διάγνωση λύσσας.
  • Η λύσσα στο ζώο και η ανοσοποίηση μετά την έκθεση του ασθενούς αποτρέπει την ανάπτυξη λύσσας.
  • Πρωτοπαθής έρπης των γεννητικών οργάνων.
  • Μωρό που γεννήθηκε από μητέρα θετική HBsAg.
• Έλεγχος αιμοδοτών: Για την πρόληψη ορισμένων ασθενειών (όπως ο έλεγχος για HBV και HIV σε αιμοδότες).
• Έγκαιρη ανίχνευση επικίνδυνων επιδημιών: Όπως κίτρινος πυρετός, εγκεφαλίτιδα, γρίπη, πολιομυελίτιδα κ.λπ.
• Για να ανακαλύψετε νέους ιούς: Ο HIV ανακαλύφθηκε το 1983.

Δείγματα

Τα κατάλληλα δείγματα θα πρέπει να συλλέγονται από ασθενείς, να συντηρούνται και να μεταφέρονται στο εργαστήριο με τον κατάλληλο τρόπο μαζί με τις σχετικές κλινικές και επιδημιολογικές πληροφορίες.

Μέθοδοι Εργαστηριακής Διάγνωσης Ιογενών Λοιμώξεων

1. Άμεση ανίχνευση ιού
2. Απομόνωση και ανάπτυξη ιών
3. Ανίχνευση ιικών πρωτεϊνών
4. Ανίχνευση ιικού γενετικού υλικού
5. Ορρολογία

Άμεση ανίχνευση ιών

• Ηλεκτρονική μικροσκοπία (EM): Οι κλινικές εφαρμογές της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας περιλαμβάνουν την ανίχνευση ιού ροταϊού και ηπατίτιδας Α σε δείγματα κοπράνων, ιούς ευλογιάς σε υγρό κυστιδίων και ιού έρπητα σε ιστό βιοψίας εγκεφάλου.
• Ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία: Η προσθήκη ειδικού για τον ιό αντισώματος σε ένα δείγμα μπορεί να προκαλέσει συσσώρευση ιικών σωματιδίων, διευκολύνοντας έτσι την ανίχνευση και την ταυτόχρονη ταυτοποίηση του ιού (ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία). Αυτή η μέθοδος είναι χρήσιμη για την ανίχνευση εντερικών ιών, όπως ο ροταϊός.
• Μικροσκοπία φθορισμού: Η άμεση ή έμμεση τεχνική αντισωμάτων φθορισμού μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ιοσωμάτων ή ιικών αντιγόνων σε τομές κατεψυγμένου ιστού, κυτταρικά επιχρίσματα σταθεροποιημένα με ακετόνη, κύτταρα από καλλιέργειες μολυσμένες με ιό ή υγρό κυστιδίων. Το μικροσκόπιο φθορισμού της βιοψίας εγκεφάλου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επαλήθευση της λύσσας στον εγκέφαλο ζώων για τα οποία υπάρχει υποψία ότι είναι λυσσασμένα. Αυτή η μέθοδος είναι επίσης χρήσιμη για την ταχεία διάγνωση λοιμώξεων του αναπνευστικού που προκαλούνται από παραμυξοϊούς, ορθομυξοϊούς, αδενοϊούς και ιούς έρπητα.
• Μικροσκοπία φωτός: Η επίδειξη του σώματος εγκλεισμού είναι μια συνηθισμένη διαγνωστική μέθοδος. Η λύσσα μπορεί να ανιχνευθεί μέσω της εύρεσης σωμάτων Negri (ενσωματώσεις ιού της λύσσας) σε εγκεφαλικά κύτταρα ζώων.

Απομόνωση ιών

Για την απομόνωση του ιού είναι επιτακτική ανάγκη το δείγμα να συλλέγεται σωστά και να μεταφέρεται με τη μικρότερη καθυστέρηση στο εργαστήριο. Οι λόγοι είναι ότι πολλοί ιοί είναι ασταθείς και ότι τα δείγματα είναι ευαίσθητα σε βακτηριακή και μυκητιακή υπερανάπτυξη. Οι ιοί μεταφέρονται και αποθηκεύονται καλύτερα σε πάγο και σε ειδικά μέσα.

Γενικά, οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση συνίστανται στον ενοφθαλμισμό σε ζώα, αυγά ή καλλιέργεια ιστών, μετά την επεξεργασία του δείγματος για την απομάκρυνση βακτηριακών μολυσματικών ουσιών. Τα προϊόντα απομόνωσης αναγνωρίζονται με εξουδετέρωση ή άλλες κατάλληλες ορολογικές διαδικασίες. Πολλοί ιοί (για παράδειγμα αδενοϊοί, εντεροϊοί) βρίσκονται συχνά σε φυσιολογικά άτομα. Τα αποτελέσματα της απομόνωσης θα πρέπει πάντα να ερμηνεύονται υπό το φως των κλινικών δεδομένων.

Ανίχνευση Ιικών Πρωτεϊνών

Οι ιικές πρωτεΐνες μπορούν να προσδιοριστούν με τις ακόλουθες μεθόδους:

• Μοτίβα πρωτεΐνης (με ηλεκτροφόρηση) – HSV.
• Ενζυμικές δραστηριότητες (π.χ. αντίστροφη μεταγραφάση) — Ρετροϊός.
• Αιμοσυγκόλληση και αιμοπροσρόφηση – Ιός γρίπης.
• Ανίχνευση αντιγόνου: Τα ιικά αντιγόνα στην κυτταρική επιφάνεια ή εντός του κυττάρου μπορούν να ανιχνευθούν με ανοσοφθορισμό και ενζυμική ανοσοδοκιμασία (ΕΙΑ).
• Ο ιός ή το αντιγόνο που απελευθερώνεται από μολυσμένα κύτταρα μπορεί να ανιχνευθεί με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA), ραδιοανοσοδοκιμασία (RIA) και συγκόλληση λατέξ (LA).

Ανίχνευση Ιογενετικού Υλικού

• Τα ηλεκτροφορητικά μοτίβα του RNA (γρίππη, ρεοϊός) ή τα μήκη θραυσμάτων περιοριστικής ενδονουκλεάσης από ιικά γονιδιώματα DNA είναι σαν γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα για αυτούς τους ιούς.
  • Διαφορετικά στελέχη HSV-l και HSV-2 μπορούν να διακριθούν με αυτόν τον τρόπο από πολυμορφισμό μήκους περιοριστικού θραύσματος.
• Ανιχνευτές DNA:
  • Οι ανιχνευτές DNA με αλληλουχίες συμπληρωματικές σε συγκεκριμένες περιοχές ενός ιικού γονιδιώματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν, όπως τα αντισώματα, ως ευαίσθητα και ειδικά εργαλεία για την ανίχνευση ενός ιού.
  • Αλληλουχίες νουκλεϊκού οξέος (DNA ή RNA) που είναι σημασμένες με ένζυμα ή ραδιοσημασμένες, συμπληρωματικές σε μοναδικές περιοχές σε αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων των περισσότερων ιών, κατασκευάζονται τώρα εμπορικά. Αυτές οι επισημασμένες συμπληρωματικές αλληλουχίες είναι γνωστές ως ανιχνευτές νουκλεϊκού οξέος.
  • Δύο κλώνοι του μορίου DNA στόχου στα κλινικά δείγματα διαχωρίζονται πρώτα και, στη συνέχεια, αφήνονται να υβριδοποιηθούν με έναν επισημασμένο μονόκλωνο ανιχνευτή DNA ή RNA που υπάρχει σε περίσσεια.
  • Ανάλογα με τον τύπο της ετικέτας που προσαρτάται στον ανιχνευτή, ο υβριδοποιημένος επισημασμένος ανιχνευτής μπορεί να ανιχνευθεί με ακτινογραφία, μέτρηση γάμμα ή απλή χρωματομετρική αξιολόγηση (υβριδισμός κηλίδας τελείας).
  • Οι ανιχνευτές DNA ανιχνεύονται με αυτοραδιογραφία ή με μεθόδους φθορισμού ή τύπου EIA. Με τη χρήση ανιχνευτών νουκλεϊκού οξέος έχουν ταυτοποιηθεί ο κυτταρομεγαλοϊός, ο ιός των θηλωμάτων και ο ιός Epstein-Barr.
• Ανάλυση κηλίδας Southern, Northern και D Dot:
  • Τα ιικά γονιδιώματα μπορούν επίσης να ανιχνευθούν σε κλινικά δείγματα με τη χρήση της ανάλυσης κηλίδας κηλίδας ή Southern blot.
  • Ηλεκτροφορητικά διαχωρισμένο ιικό RNA (Northern blot-RNA: DNA probe hybridization) στυπωμένο σε ένα φίλτρο νιτροκυτταρίνης μπορεί να ανιχνευθεί με παρόμοιο τρόπο.
• Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης:
  • Οι αναλύσεις αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) για DNA, αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (RTPCR) για RNA και DNA διακλαδισμένης αλυσίδας (DNA, RNA) γίνονται πολύ σημαντικές για την ανίχνευση ιών.
  • Η χρήση των κατάλληλων εκκινητών για PCR μπορεί να προάγει εκατομμυριοπλάσια ενίσχυση μιας αλληλουχίας στόχου σε λίγες ώρες.
  • Αυτή η τεχνική είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την ανίχνευση λανθάνουσας και ολοκληρωμένης αλληλουχίας ιών, όπως ρετροϊών, ιών έρπητα, ιών θηλωμάτων και άλλων παποϊών, καθώς και των αλληλουχιών ιών που υπάρχουν σε χαμηλές συγκεντρώσεις.
• Αλυσίδα πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης αντίδραση (RT-PCR) για RNA: Αυτή η προσέγγιση ήταν πολύ χρήσιμη για τον εντοπισμό και τη διάκριση των Hantaviruses.
• Δοκιμασίες DNA διακλαδισμένης αλυσίδας: Ποσοτικοποιήστε το DNA ή το RNA του ιού όπως το ELISA.

Ορολογική Διάγνωση

• Η επίδειξη αύξησης του τίτλου των αντισωμάτων σε έναν ιό κατά τη διάρκεια μιας ασθένειας είναι ισχυρή απόδειξη ότι είναι ο αιτιολογικός παράγοντας.
• Για αυτό, είναι απαραίτητο να εξεταστούν οι ζευγαρωμένοι οροί, το «οξύ» δείγμα που συλλέγεται νωρίς στην πορεία της νόσου και το δείγμα «ανάρρωσης» που συλλέγεται 10-14 ημέρες αργότερα.
• Η εξέταση ενός μεμονωμένου δείγματος ορού για αντισώματα μπορεί να μην έχει νόημα, εκτός από την περίπτωση που γίνονται ειδικές εξετάσεις IgM, οι οποίες είναι παρούσες κατά τις πρώτες 2 ή 3 εβδομάδες μιας πρωτοπαθούς λοίμωξης, γενικά υποδηλώνουν πρόσφατη πρωτοπαθή λοίμωξη.
• Οι ορολογικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται θα εξαρτώνται από τον ιό, αλλά αυτές σε γενικές χρήσεις είναι εξουδετέρωση, στερέωση συμπληρώματος, ELISA, δοκιμές αναστολής αιμοσυγκόλλησης, έμμεση δοκιμή αντισωμάτων φθορισμού, δοκιμή συγκόλλησης λατέξ.

Αναφορά και Πηγές

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7149825/
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7152307/
• https://www.merckvetmanual.com/clinical-pathology-and-procedures/collection-and-submission-oflaboratory-samples/collection-and-submission-of-laboratory-samples-from-animals
• https://www.coursehero.com/file/55585058/030-Laboratory-Diagnosis-of-Viral-Infections-2020ppt/
• https://ebin.pub/integrated-risk-of-pandemic-covid-19-impacts-resilience-and-recommendations-1sted-9789811576782-9789811576799.html
• https://www.coursehero.com/file/p3vc2kg7/the-target-sites-lead-to-distinctive-lesions-INCUBATION-PERIODThe-incubation/
• https://quizlet.com/173848059/dsp-micro-viruses-flash-cards/
• https://www.researchgate.net/publication/5678192_Clinical_comparison_of_branched_DNA_and_reverse_transcriptase-PCR_and_nucleic_acid_sequencebased_amplification_assay_for_the_quantitation_of_binant_formim1_BC_RNA

Διαβάστε επίσης: